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上海帛科生物技術有限公司
   
     
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CHO 殘留 DNA 檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)
  • 品牌:帛科
  • 發布日期: 2022-10-14
  • 更新日期: 2025-03-14
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品牌 帛科
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CHO 殘留 DNA 檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)試劑盒簡介:

CHO 殘留DNA 檢測試劑盒是用于定量檢測各種生物制品及藥品的中間品、半成品和成 品中殘留的 CHO  宿主細胞 DNA。
本試劑盒利用 Taqman 探針法, 定量檢測樣本中 CHO  殘留 DNA。該方法具有速度快、 特異性高、  性能可靠且 檢測限可達到 fg 級別。
試劑盒組份:

表 1:試劑盒組份

試劑 裝量 貯存條件
CHO control DNA 40ul×1 管 -20oC
DNA dilution buffer 6ml ×1 瓶 -20oC
2×Taqman master mix (+UNG/ROX) 0.75ml ×2 管 -20oC
10×CHO qPCR mix 0.3ml ×1 管 -20oC
RNase-Free H2O 1.5ml×1 管 -20oC
規格 :100  反應
適用機型:
PRISM 7500 Real-Time PCR System (ABI)
StepOne Plus Real-Time PCR System (ABI)
LightCycler 480 (Roche)
AriaMX (Agilent Technologies)
CFX (BIO-RAD)

實驗所需但試劑盒未包含材料:

? 1.5ml 無菌低吸附離心管
? 96 孔 qPCR  板
? 一次性手套
? 1000ul 、100ul 、10ul 無菌低吸附帶濾芯移液槍頭

實驗操作過程:


一、 CHO DNA 定量參考品的稀釋及標準曲線的制備

用試劑盒中提供的 DNA dilution buffer CHO control DNA 進行梯度稀釋, 稀釋濃度依 次為 300pg/ul 、30pg/ul 、3pg/ul 、300fg/ul 、30fg/ul 、3fg/ul 。具體操作如下:

1.將試劑盒中的 CHO control DNA DNA dilution buffer 置于冰上融化,待完全融化后,

輕微振蕩混勻,簡短快速離心。

2. 6 支干凈的 1.5ml 離心管,分別標記為 SD1 SD2 SD3 SD4 SD5, SD6

3SD1 管中加入 198ul DNA dilution buffer,其余管中分別加入 180ul DNA dilution buffer

4, 2ul  CHO  control  DNA 加入 SD1 管中, 然后渦旋振蕩混勻 5- 10s 后短時快速離心 5s,渦旋振蕩和快速離心各重復 3 次。

5,按表 2 依次進 6 次梯度稀釋操作,稀釋操作同步驟 4。

2. CHO control DNA 的稀釋

釋管

釋體積

濃度

SD1

2ul CHO control DNA+198ul DNA dilution buffer

300 pg/ul

SD2

20ul SD1+180ul DNA dilution buffer

30 pg/ul

SD3

20ul SD2+180ul DNA dilution buffer

3 pg/ul

SD4

20ul SD3+180ul DNA dilution buffer

300 fg/ul

SD5

20ul SD4+180ul DNA dilution buffer

30 fg/ul

SD6

20ul SD5+180ul DNA dilution buffer

3 fg/ul

二、加樣回收質控 ERC 的制備

根據待測樣本的殘留量設置 ERC CHO  control  DNA 的加樣濃度 (以制備加 45pg  CHO control DNA 的樣本 ERC 為例),操作如下:

1,取待測樣本 100u,加至 1.5ml 凈的離心管中;

2,加入 1.5ul SD2,混勻,標記為樣本 ERC。

:樣本 ERC 和同批待測樣本需一起進行樣本前處理。

三、陰性質控 NEG 的制備

根據實驗設置陰性質控,操作如下:

1,取 100ul 樣本基質溶液(或洗脫液)加至 1.5ml 干凈的離心管中標記為陰性質控 NEG。 注:陰性質控 NEG 樣本和同批待測樣本需一起進行樣本前處理。

四、 qPCR 反應液的制備和加樣

1,根據所要檢測的標準曲線及待測樣本數量,計算所需反應孔數,一般做 3 個重復孔/樣。

反應孔數=  (6 個濃度梯度+1 個無模板對照 NTC+1 個陰性質控 NEG+待測樣本×2) ×3 注:待測樣本×2 是為了讓每個待測樣本檢測時都同時做樣本 ERC 。                  2,根據反應孔數計算本次實驗所需的各組分的所需總量以制備 pre-mix:

2×Taqman master mix=(反應孔數+2) ×15ul    (含有 2 孔的損失量)

10×CHO qPCR mix=  (反應孔數+2) ×3ul

RNase-free H2O=  (反應孔數+2) ×2ul

3,各試劑置于冰上融化,振蕩混勻,按表 3 所示進行加樣:

表 3.各反應孔加樣示例


標準曲

20ul pre-mix+ 10ul SD1/SD2/SD3/SD4/SD5/SD6

NTC

20ul pre-mix+ 10ul DNA dilution buffer

NEG

20ul pre-mix+ 10ul NEG

測樣本

20ul pre-mix+ 10ul 待測樣本

ERC 樣本

20ul pre-mix+ 10ul ERC 樣本


加樣完成后每孔總體積為 30ul


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