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上海帛科生物技術有限公司
   
     
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馬紅球菌探針法熒光定量PCR檢測試劑盒使用方法

發(fā)表時間:2024-03-14
馬紅球菌探針法熒光定量PCR檢測試劑盒使用方法:

1. 樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1 樣本前處理

按照試劑盒操作說明或者微生物樣品處理方法做好樣品前處理。

1.2 DNA 提取

根據(jù)您實驗室的具體情況和樣品類型,選擇適當?shù)奶崛〔呗苑椒ā榱耸箤嶒灲Y果穩(wěn)定、有效、可靠,我們建議使用商品化的試劑盒進行提取,嚴格按照對應試劑盒說明書進行操作,樣本核酸提取過程中應避免污染,提取好的模板樣品如不能立即檢測,建議-15℃以下保存。

推薦采用我們公司研發(fā)生產的試劑盒:Hypure 病毒基因組 DNA 提取試劑盒

2. 試劑配制(試劑準備區(qū))

2.1 從-15℃以下冰箱中取出試劑盒平衡到室溫(20~25℃),注意避免強光照射,待完全溶解后振蕩混勻并低速離心 10 s,使用低吸附吸頭分液取樣,避免試劑損失和浪費。

2.2 根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;樣品每滿 7 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下表:

試劑

鮭腎桿菌反應液

鮭腎桿菌擴增液

用量(樣本數(shù)為N)

19.5μL

0.5μL

2.3 在適當容積的無菌離心管中加入上述試劑,充分振蕩混勻后 2000 rpm 離心 10 s,按照 20 μL/管分裝量將試劑分裝至八聯(lián) PCR 反應管中。

2.4 蓋緊八聯(lián) PCR 反應管蓋, 并注意做好相應標識(請標記在八聯(lián) PCR 反應管蓋兩端突出部位,切勿標記在八聯(lián) PCR 反應管蓋中間,以免影響信號采集)。將 PCR 反應管轉移至樣本準備區(qū),剩余試劑放回-15℃以下冰箱冷凍保存。

3. 加樣(樣本處理區(qū))

將步驟 1.2 提取的 DNA、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心,核酸加樣過程中應避免污染。

4. PCR 擴增(核酸擴增區(qū))

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內, 并記錄放置順序。

4.2 設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25 μL;

熒光通道選擇:檢測通道選擇 FAM, 淬滅通道選擇 NONE,參比熒光選 NONE。

4.4 推薦循環(huán)參數(shù)設置:

步驟

循環(huán)數(shù)

溫度

時間

收集熒光信號

1

1 cycle

95℃

3min



2

40 cycle

95℃

15sec



55℃

30sec



5. 結果分析判定

5.1 結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機器自動分析的結果分析,當曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節(jié)),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結果。

5.2 結果判斷

陽性:檢測通道 Ct 值≤35.0,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑:檢測通道 Ct 值>35.0,且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復試驗,重復試驗結果出現(xiàn) Ct 值≤38.0 和典型擴增曲線者為陽性,否則為陰性。

陰性:檢測結果 Ct 值無 Ct 值,無明顯的擴增曲線。

6. 質控標準

陰性質控品:無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示;

陽性質控品:擴增曲線有明顯指數(shù)生長期,且 Ct 值≤30;

以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。

7. 產品性能指標

陰陽性參考品符合率:5 份陽性參考品符合率為 100%;10 份陰性參考品符合率為 100%。

最低檢測限:1.0×103copies/mL。

精密度:批內、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數(shù)(CV)均小于等于 3%。

8. 檢測方法的局限性

樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關;

樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結果;

陽性對照、擴增產物泄漏,會導致假陽性結果;

病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結果;

不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結果;

試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果;

本檢測結果僅供參考,如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。


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